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/ ]7 r3 x2 x; k8 G+ \* M! i1 B 中图分类号：X703 文献标识码：A 文章编号：1009－2455（200）06－0032－03# e- w9 E F* j0 t9 F; p; i# ^6 |
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3 J$ c$ F( T2 G4 [; t6 V$ ]9 Q
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1 a* J$ P8 p/ ]5 R7 P' v0 c/ z
# F$ R: s/ }4 `) R4 J. f* A! d* a' g. {# e& h; y7 q' q. q; B! y
中图分类号：X703 文献标识码：A 文章编号：1009－2455（200）06－0032－03& F; Z& b: e# c2 o" i) h6 M
An Experimental Study on Microbiological Treatment of Lubricating Oil-Contaminated WaterLlU Qin-ya, ZHOU Hai-dong(College of Environmental and Spatial Informatics, China University of Mining and Technology, Xuzhou 221008, China) 0 D2 F+ \6 K) V& W
Abstract: Two strains of high-effective, lubricating oil degrading bacteria, ZL1 and ZL2, were screened out from oil-contaminated soil, which were preliminarily identified as flavobacteriun and tnicrococcus. The effects of temperature, oil content and pH value on their oil-degrading capacities were dletermined by orthogonal experiment of growth conditions. A degrading capacity experiment was carried out with an initial wastewater oil content of 270 mg/L. The experimental results showed that the oil removal rates by the strains ZL1 and ZL2 from the in-oculum in about 2 days were up to 67. 9% and 76. 2% respectively and the adaptation range of strain ZL2 to oil content and pH value was wider than that of ZL1. Key Words: lubricating oil; oil-containing wastewater; wastewater treatment; microorganism; flavobacteri-un; micrococcus
' s+ ~' S0 X0 h 近年来，国内外对石油及兵产品的微生物降解研究常见报道，却鲜见机油废水微生物降解方面的研究。本试验目的是通过常规微生物驯化方法，以市售机油为唯一碳源，从油污土壤中分离筛选出机油高效降解菌株，并对其生长条件及降解特性进行研究，以期进一步应用于含油污水的治理。 # w9 ]7 v5 I3 _) v6 d/ q
1 材料与方法
`! T& l p% u' D& o* M( K1．1 土壤样品 某石油库贮油罐附近的石油污染土壤，取样3份，按含油量由多至少编为1＃，2＃，3＃。1．2 培养基 本试验选取两种无机基础培养基，（用蒸馏水配制并高压蒸气灭菌），编号分别为1＃，2＃，组成如下： 1＃基础培养基：p（KH2PO4）＝0.5g／L，ρ（K2HPO4）＝0.5g／L，P（MgSO4·7H2O）=0.2g／L，ρ（NaCl）=0.2g／L，p（CaCl2）＝0.1g／L，ρ（NH4NO3）＝1.0g／L，MnSO4痕量，FeCl3痕量。 2＃基础培养基：p（NaNO3）=2.0g／L，ρ（KH2O4）＝0．2g／L，ρ（MgSO4.7H2O）＝0.2g／L，ρ（酵母浸膏）＝1.0g／L． 含油培养基是向上述无机基础培养基中加入适量机油。固体培养基中加入质量分数为0．2％的琼脂。1．3 优势菌筛分试验1．3．1 选择富集培养 称取土样各10g，加入到500mL1＃含油培养基（含机油4mL）中，调pH值7.0，通气恒温30℃培养48h后，分别移取上述培养液5mL于45mL1＃，2＃含油培养基（含机油2mL）中，恒温30℃振荡培养。1.3.2 平板分离 制作1＃，2＃固体含油培养基平板苦干，用接种环蘸取振荡培养较好的菌液在相应平板划线，恒温30℃培养48h后平板划线分离，重复数次。选择生长状况良好的菌株进行平板扩大培养。1．4 生长条件正交试验 在保证供氧和氮、磷营养前提下，选择温度。油的质量浓度（以mg／L计）和pH值作为本次实验的三个因素进行三水平实验，方案见表1、表2。将平板培养48h的菌体刮下，5000r／min离心5min，分离得到湿菌体。向方案中每个样品加入0.5g湿菌体，培养60h后测定样品中油的质量浓度。 : C5 N" e7 ]& j0 F ~" A
表1 ZL1菌株正交试验方案及试验结果 2 f' ]$ D. c8 c) o5 }: j
+ l. k y q: A0 ] N( E1 g
- F/ h0 {* E" [4 i
- w, _7 A; g2 b: r; X
m4 V' u' J' e. J分组号
4 _5 O* k8 r3 B1 y# E因素4 y) ~9 z0 h1 q& b8 ^6 N
测定结果ρ（油）/（mg.L-1)
' `! C" U" _; ^3 `3 [& c降解测量ρ（油）/（mg.L-1)
6 W( B: k5 N7 d5 C( K% k1 J
" v _& `5 A) ~- `9 ^. n7 R温度/* s' Q+ |& N$ m/ ?
ρ（油）/（mg.L-1)
. v% b' a4 ^1 t2 ?1 i7 `; }pH值
2 }: ~3 O% A. b# |3 B2 S z7 b7 v) v7 C
1
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424* [( F, Z4 [- a/ u* T4 P
5.01 r) F0 u9 o* r/ A4 a
192
# C3 a+ q9 i* z0 R" a232$ D6 V2 F3 _! ?- B+ d! }
# d; d+ Y* |6 j; a' x/ V
2# f V/ W1 o8 s7 W2 b( |" k% R
25
3 o0 o, O0 @3 z5 g680* L1 v3 U+ z6 M* U9 }
7.0+ Z8 c0 q0 J2 _. ?8 A6 g; a
416, x/ J$ M0 \2 k6 f9 q% l
2642 J" j- U) R2 q
0 p$ ?8 e3 b; P7 V% O( U( e
3
. ` M/ M- n/ u% v$ P I25
* D3 M- ]) j* j/ I- W* j" {824
% F8 @, r* |/ W9.06 H" n; k8 [! c6 @
6301 O7 v0 ~5 G* _) X9 Y
1949 n8 w) @; p1 x& Z+ I, z5 M# u
}/ G6 {. q9 F9 K2 ^4' ~. z* N6 W7 F+ T
30
5 I( p$ u0 r% j$ [! N+ J; A4249 J7 h W' n& } J8 s
7.01 d$ f0 C- g, \- c
220
& l: Q# L, I% C204, O3 w& I( l: V2 A& g a5 p
6 \" F" l% t% p. N" m$ c( Q1 F, s4 v5
; w* l$ m/ a) g- q5 z7 o4 {1 a30& {1 Z/ h# s) z' O; K6 l* _7 s
680
2 F% d1 L$ X& K( N+ j" E9.0
/ G3 q9 w' W; W3 _3 R% B; k; W; u507- X( _+ ?' t6 m7 w9 T+ ^( B
173+ e! h) b/ b8 \& _: s
2 ], w9 w$ @% l b6/ E9 g4 ^4 t; Z7 D% H7 q
30" Z% c, Q" y' t- a0 e; ]- ?
824
* x/ s, q8 }1 y; E5.0# T/ F, M1 k6 _
6549 N' v; l: Y# n
170# k9 U) J! T1 q4 u& N; K. @5 }+ z' A
) _5 ~3 y# ^( B$ H1 ?
76 y# h4 v/ N, C9 m: g; B o
35, O# g7 O- ]; C, x# L+ N& j" O
424, W+ R& N8 g- ?2 r% R. r
9.0
: T. `4 o! W8 ?& w9 q2976 q) Q6 V: W7 r" U! z! T$ |- h
127
6 v' ^( e7 k# V( N! o( e" d. X0 Z3 Q, H2 ^
8+ O# B2 W+ ]. X4 o
353 z U% H1 w9 B% n2 V
680
( O& Z8 |$ G' L5.0
: f8 W9 f3 i5 i( J4 M569
9 \0 I$ o2 x6 m( R111" Y# V' ~" ~7 C
- m& f5 H; c. \- K0 D9& k% K# s# V1 W3 B) W- _
35
3 z, q5 ]# B' ]9 L6 ^) L$ M4 m824) ]! `# Z; s0 ], v
7.02 v& s! _) k2 g$ }$ e5 a
755
. V$ H" I; F! ]69
: A. e! i3 z0 x8 D, M
6 F% i. d8 p* g0 Z7 D! J$ \K1* `" ]8 l1 R& h1 e7 f' G, g8 ?; J
690' \- a, @. l/ e9 A" j- M
563
$ c0 l- H! H4 C6 ?4 B; }" X513/ X# h0 t2 u0 O1 f# L; i
% W8 c+ ~+ h) X1 I
2 l# e' |- S3 t7 K) O; C
& }9 ^% Y: o* @K2
) M* j1 }' z6 ]547/ s$ j* C. x! S/ j
548
: {& r4 W# _- q0 k) H* R$ M/ A, `537
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3 N5 V! ~( w' q( r8 {
2 {% c w$ W4 W8 I* ~/ U5 {( h2 g0 r. v. ]- L; l% G
K3$ r$ `2 C8 Y7 a8 U: E o5 ?8 d f
3074 N0 K6 u9 v5 }9 x2 N* Q2 O# N6 m
433
' K. M) [2 Q, W+ e494
- [6 r* y8 O& [8 a" Y$ V0 u9 h , i* B/ D- w2 l; ?
# B/ H m8 W8 K- q- g: G% c* S
1 I' k! O/ B/ c$ wK1# }, W3 l- [7 s* X
230! l' T6 x+ ]4 q; z- ]9 {
1882 p* ^: C9 b' [ F
171% ]( m g5 C# ?) x
/ R( r+ b! G$ ^7 D' e) O/ k" o
+ {" ~: O+ `$ t- B% G: J2 S& R( ^ Q' Z
K2
6 Q. P: D1 s# Z- H3 t* M$ W9 B! t182
+ z% z1 H' j8 f& p- [ P* v' d3 w1831 f, f& V9 S! [, ] W0 \
179
. ? F: c* f, F$ r4 @ 0 X' g: Q" K! R7 ^" D1 o1 Y, P
- T( D2 f" H- `4 q7 l' c( y
& a7 p- i, K8 Z. e
K37 \$ H8 Q/ {. N. X& }* q9 }
102$ i# J9 t: f* \
144
2 A: }4 N: a2 Z- ~5 W; F Y8 W165
3 P( n5 Y7 x& l) Y, @/ C% r7 l
! O8 W2 F0 c# X * O/ ]8 v- \ D- F
- u# a* H, J+ ?$ \4 S
R
8 B5 p: ?* o, N: s( ]3 o128
( {1 n- G/ ?: r7 ]/ J44
( y+ J. J8 Q+ ]; h14& ?5 g8 K' V* l
& k8 v: ^1 q0 a+ n5 D4 p8 h! W
' `; E0 _4 V# r表2 ZL2菌株正交试验方案及试验结果 , e7 l3 ~* f6 ]- s9 r9 s; I
, Z$ R1 A! k) c" E9 X- Y9 B
& m- u" q" V: I) Q/ e
9 L3 l& q* j# |- X* s5 ?8 G i8 w
分组号% D( o$ T# O; ]
因素9 ~, W! C' i# s/ T
测定结果ρ（油）/（mg.L-1)+ E1 l" L) {* J4 N% T2 B [! s
降解测量ρ（油）/（mg.L-1)
1 Y. _6 F# o: ^3 U& v& O# L/ E% C& O! \4 ~4 t1 J1 f4 _8 [
温度/: r9 \" Z5 f8 z
ρ（油）/（mg.L-1)8 m" A7 B' D. }# \
pH值8 \' S3 E) _9 o/ x7 K4 R
) s4 a* O6 W2 H5 c4 v' }: r1
' C; `8 }( ?3 r/ c) z( R3 |25, y c1 I0 o' R; P
368
4 k/ {0 E( o( J4.0
+ }: _) A+ c- u% f69/ u* }( O, X7 X; a, E
2994 v4 \- H! W& [% p! T
" c4 \1 p! U9 F0 O3 s0 W' ~
2
9 j$ Z3 i: }1 R7 _257 @% S+ O' n+ }0 P
574
$ o. \ J# G( C4 c( V# U4 k' z6.0
6 Q! k* M8 u8 @% I; B) Q267
5 h R1 _% H) u S307
* U6 |( G% F: }5 A$ a
$ M3 ?# d) `# M5 M- P. D) E3 z" f* p4 H' e A( ]
253 N. \ z+ q$ }
767
& ^7 H8 {5 F$ Q- ]5 f2 S8.0( }$ W& o! X. Z6 o9 P7 c4 {
4794 r9 Z/ q3 Y; a4 q1 H9 K( J
288" i6 `6 A) s4 w2 G4 _
( a7 o: ], x2 b3 f9 G$ |
45 p. x# ?+ D: i J; c5 i( p* h" _
30/ e/ A- ]% F' f: K. m
368: p( j. z2 r H" p' H j
6.0
+ Y. }9 \4 b* D# M3542 `! W* t; c; i7 H
314
( S% F& H4 S8 }! F0 U0 {
9 r9 X7 ]! G; f& ]3 H5
- F- l8 ^4 k4 h4 h5 \0 r, i- D30- C+ H7 `" N: p! V
5747 X- B1 H$ Q, f, `/ V
8.01 a+ a* s) m2 ~: I! S; j
296
: }/ _ z$ ^/ E h4 e6 p278
, Z: v0 d) Y% q) W
% X% e, p. k9 C% z6
/ B' f* s2 U2 `. ]! X+ X8 ]30
1 o! f) Q) C1 X- `' q- g" K767
5 A4 E, S& y# D# T6 S4.0! P+ F5 ]2 ~. g1 [9 j, ]
462) s. J: T- |: t+ ~- x& S4 E
305
0 g2 f J6 f. S2 [' E$ x9 A N& d
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6 L8 e% F4 x8 Z: `% u: Z1 A35
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8.01 v+ w. f" w- q, }
142# m8 k1 q- a* L0 C- D
226
+ \6 D; e. A Q% r2 J# R# Z* b7 K
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35) g# G4 b, y$ g- `% c4 D* E+ h/ W
5742 E# t3 m% }" N; t
4.0* a( R' \6 x' c/ \" L: V
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* d5 F9 B2 ]2 `0 ~9 T- r232/ F; X/ r, j; a& a
9 }/ ^1 t/ |% N9 P; }4 }' B) Z8 J9+ P! O: Z& }4 X6 S) @8 T
35
. I, z* ?# u$ `1 e& o767
4 A2 W2 R2 }8 J, A' Q- x6.0" f: y+ E7 _5 X' x6 X
5486 `2 X7 | H0 H4 m1 d* j
219
: g% `/ F* n! u6 s2 Q, \
! [! o* l0 A+ K% O0 o- o: }. D0 NK1; t4 m, N6 A% s: B% \8 w- \1 N
824
& d# [% r! K. w# v7698 a: O* ?8 I; v1 X) {& Z
766
8 H9 {7 @- M- s7 j
6 Z; K3 z* ~6 d I1 o# L) h) c
; n" ]" O. K8 P% o9 I$ ]
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8971 O4 P8 x( e9 F g) X8 T0 u
817
4 j3 ~7 V" u$ e840
1 \( A* j6 t/ i6 }7 l! H S2 A. p% C+ [+ l8 H( t( {
4 m& u# N7 O) j" j# ?# q
4 |% ?5 w! s; x7 I* n1 v s: o7 l( PK3( E9 u, _- p7 b$ H3 ^+ } g3 C t
677
- s/ R4 ~& c" D, r# N# y3 c$ ?; @812
" ?. N% a9 O+ [* A+ G. X2 Q0 B792, W% `$ T' {1 }
9 {9 E1 @% @( {6 W) U. }
* e; y5 n$ S. o# Z5 _& t! D
" l5 q0 ~. B* p; c5 Z' s! rK1
1 [5 p- c4 D# Y: ~ t, D2 a$ c275
! T7 |+ a: M; i256
9 S# N& L0 |5 Y3 ?7 \! P& L" W* b/ ^2555 S- N ~4 u( Y8 ]" `/ m( J
% ~4 n& M4 ^+ {2 `0 D( [; V( L' m
8 C- V7 }- @5 }0 [' y# A6 H9 ]' l+ a6 E" m& L
K2 y: O, P7 R" g- ~5 U% f! |8 E
299
) z! k# Q' _5 T" l5 R/ _# v f272
/ G' L8 G" U5 C8 t$ f: c* u280
]! X0 w# |8 C; p& i! R* T, ~' \" n
8 _% j, Z6 j2 ?2 s) c1 }4 B8 e ; Y: Y s3 x, A5 ?4 X! |1 q
5 u# L4 a& f* h; N s) k
K3
' ?, D3 M6 Q5 S226
- @9 y' n, |9 o7 C! M) |3 i4 ?1 h271
) K/ I2 Z4 k I# D( y& |( r264
/ o" h# G/ e- n; E& U6 I ; s) i% J1 i) Y% J
/ O% ?' b& ^5 R+ j* m
3 b: o& C2 t& f9 T) B9 C$ RR: N, \9 ]: I% s4 s
735 _; v% ]& w7 ?6 z: M- O( a& P, w
16
" \' F) B2 C; O/ R) U5 T3 H25
5 i# {. `( d- }
/ C$ @% j- G& u8 Q" l: N
; j8 y3 a* i, F- R1 X3 W/ {" O1.5 降解能力试验 配制机油质量浓度为270mg／L的含油培养基1L，投入小型间歇反应器中，加入离心分离得到的湿菌体5g，通气恒温30℃培养，间隔12h取样测定其含油量。1．6 测试方法 用紫外介光光度法测定。 / K) L$ ?$ R/ M! n6 B( U
2 结果分析 # A# y& e" [* u9 b& W- K
2．1 优势菌筛分试验 富集培养过程中，1＃土样的培养液出现的泡沫较多，乳化现象明显，菌液也较为粘稠，分离出较多的菌株，说明土壤中的石油烃能刺激石油降解菌的生长。经过选择富集培养、平板分离出4株以机油为唯一碳源的菌株，编号为ZL1，ZL2，ZL3，ZL4，性状见表3。进一步培养后筛选出降解性能较好的ZL1（1＃培养基）和ZL2（2＃培养基）进行正交试验和连续培养试验。
- o$ P' W3 i6 h& a表3 4株机油降解菌形态特征
) L/ v2 M9 ]8 M5 A6 d$ a: ~- z: X# d$ k5 f( |/ k9 @( ?
* Z0 A. a, D6 K+ y4 L. r
0 v1 J) M, `3 s0 ~8 c
2 e% Q! T& c* o! B$ s
形态特征
! p/ F: Q0 V$ t* k7 _ZL1
+ F/ x) v6 H, s) W, v6 FZL2
2 \" ?6 [9 {! {6 x3 N3 _- @$ |* aZL3
& l2 B$ w: z; s6 q6 RZL4- k5 w: Q, b6 u8 R' M
$ ^ C* Z0 B' Y ^) A" d3 T菌落颜色, ]5 J4 F9 y0 q. i9 {, s( V
粉红/ g2 K+ C" X+ S6 i
淡黄
, a5 Y- }* X# U6 I2 F, j. e8 ~( i" {淡黄
* J2 ?& l. J' W1 |. _粉红
$ L$ {3 `0 s9 Z9 V- V6 F4 a
) Z6 [) c' Q1 k) C H菌落形态8 B; s* G8 m1 L2 s) T
不透明，微隆起，全缘，
" ~* N$ M: ~* I4 a半透明，圆形
+ a* A& O: @- d半透明，圆形，隆起，
5 K Y5 m# ?: f& A: ]3 b/ D不透明，米粒状突起，
- r3 U3 [; J. m2 T+ k0 a; L
% T& f; [2 J' ~# R( o 4 M, ~$ e3 S# D
光滑，有光泽
3 t) b0 v3 h& X$ B. t光滑，较干燥" }% W2 k) s" S
光滑，有光泽+ H$ C, X" S# T u$ [' O' q
较湿润
3 x! b" c, e# \" u# J7 J6 Z, ^3 `: f) |$ C+ ]
菌体形态% I* X8 z* \# {) X& ~' s& m
短杆
2 n6 \* A' S0 Q, c球形
, f5 ?7 U, E/ B# e2 Z8 L杆状
3 H$ K0 j* s3 }- [7 D) t, d丝状
% I2 b) l1 T- V# c' P1 I, u0 N/ W) J! |; A
菌体大小/μm
% Y0 U, X0 P- o2 S, F) J（0.3-0.8)×(0.6-1.0）& l) {2 b9 h- m' d$ J/ L2 e$ C, W
Φ0.3
5 z$ t+ @# C( ~& W# Z- G) ?（0.5-0.8)×(1.3-5.0)
3 S( }+ ^" A+ S a! F0 G6 v0.2×(6-60)' f( T1 y. F' t' d3 y( J
, _" p! L+ n8 u4 z' a4 d6 S革兰氏染色" c \5 z/ [( p0 r; q
G; r6 p5 w5 P9 l( a
G
% w- m; V2 W! P" }% y7 U/ PG
! w# X% i% c+ p- |" C4 eG. i$ F% j v8 n) B
$ B6 v1 [9 [- Y5 p5 W. @5 j2 q) ^初步鉴定
* T2 r b5 q" E- _& r- q黄杆菌属3 Q1 U+ i2 w, o5 H5 }6 Y( p
微球菌属/ F Q* @- S& f6 @+ }* s1 @$ x
假单胞菌属
9 `% F q& Y; {' x. }5 G酵母菌属
$ ?% s8 h! o: a, |' S }2．2 生长条件正交试验 ZL1，ZL2菌株按设定的正交试验方案进行试验，测定其剩余含油量，以降解油量作为考察指标，计算结果见表2、表3。分析极差值R可以看出：ZL1菌的R温度为128，ZL2菌的R温度为73，均为最大极差值，说明温度是影响降解效果的主要因素。25℃ZL1菌降解机油能力较强；油质量浓度越低降解效果越好；pH值为7时，降解效果最好，说明ZL1菌适于在中性条件下生长。30℃ZL2菌降解机油能力较强；机油的质量浓度在368-767mg／L范围内对降解效果影响不大，以ρ（油）=574mg／L时降解效果最明显，还应进一步扩大试验的油含量范围以确定油含量对ZL2菌降解能力的影响；pH值在4－8范围内对降解效果的影响也不显著，其中PH值为6时降解效果最好，说明ZL2菌较适于在中性偏酸条件下生长。2.3 降解能力试验 向1L油质量浓度为270mg／L培养液中投加5g湿菌体进行间歇培养，考察ZLI，ZLZ菌的降解能力，结果见图1。由含油量与培养时间关系曲线可以看出：ZL1，ZL2菌被加人含油培养基后很快适应环境，随着培养时间的增长，含油量不断下降。ZL1菌在30h左右去除率达到最大，后含油量下降缓慢，到60h左右曲线趋于平直；ZL2菌在20h左右去除率达最大，48h左右曲线趋于平直。曲线说明ZL1，ZL2菌适应能力较强，ZL1菌在0－60h内生长旺盛对机油的去除率可达67．9％，ZL2菌在0－48h内生长旺盛，对机油的去除率高达76.2％，试验后期降解曲线趋于平直，含油量基本不再变化，可能是由于机油中的一些重组分难于降解的原因。 1 K& w4 q z6 `5 U& i- i
; [( J3 y) q! r: _/ ?2 Q: S8 w( T3 结论
0 i# z3 n* x# D0 ?* J0 e* K7 {7 { ①石油污染土壤较适于做高效石油降解菌驯化菌源。筛选到两株高效机油降解菌ZL1，ZL2。通过正交试验得出ZL1黄杆菌属适于在25℃，油的质量浓度在424mg／L左右，中性条件下生长。ZL2微球菌属适于在 30℃，油的质量浓度在574mg/L左右，中性偏酸条件下生长。 ②温度对ZL1，ZL2菌的机油降解能力影响较大。ZL2菌的PH值、机油浓度适应范围较广，有较好的应用前景。 ③ZL1，ZL2菌对初始机油质量浓度为270mg／L培养液的去除率分别达到67.9％和76.2％，混合菌株的降解效果有待进一步研究。 G5 _: j# s7 U: c) k0 O, z
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l2 B1 F; D4 A5 R: Y, ^ 作者简介：刘勤亚（1977－），女，河北石家庄人，环境工程专业硕士在读。
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发表于 2010-2-21 20:12
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